Caratterizzazione dei microorganismi attivi nelle api e la loro relazione con la salute delle colonie geneticamente eterogenee

Tradotto da Cassandra Capochiani da:

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0032962#pone.0032962-Kronauer1

 

SOMMARIO

Le recenti perdite di colonie di api hanno portato ad un interesse sempre maggiore per le comunità di microorganismi associate a questi importanti impollinatori. La funzione fondamentale svolta dai batteri per le api però poco conosciuta è la trasformazione del polline raccolto dalle operaie in pan d'api, il cibo nutriente che può essere conservato per lunghi periodi all'interno delle colonie. Abbiamo usato il pirosequenziamento 16 rRNA per caratterizzare in maniera completa le comunità attive di batteri che si trovano sulle api con elevata eterogeneità genetica e geneticamente omogenee, nelle loro apparato digerente, e nel pane d'api. Questo metodo ha fornito elementi che non erano ancora mai  emersi in studi passati relativamente ai componenti e ai benefici delle comunità batteriche associate alle api. Le colonie microbiotche differiscono notevolmente tra gli ambienti campionati e sono dominati da diversi generi batterici anaerobici mai prima d'ora associati alle api, ma già noti invece per il loro utilizzo da parte dell'uomo nelle fermentazioni alimentari. Le colonie con popolazioni geneticamente eterogenee a causa del  comportamento di accoppiamento poliandrico delle regine, beneficiano di una maggiore diversità microbica, carichi di agenti patogeni ridotti, e una maggiore abbondanza di batteri verosimilmente utili, in particolare appartenenti alle specie del genere potenzialmente probiotico Bifidobacterium. In tutte le colonie, l'attività del Bifidobacterium  è correlata in maniera negativa con l'attività di generi che includono microbi patogeni; questo rapporto suggerisce una possibile chiave per capire se i batteri offrono protezione alle api. La diversità all'interno della colonia determina i batteri associati all'ape cosicché si possono avere ripercussioni importanti per la salute delle colonie. I nostri risultati chiariscono l'importanza  della simbiosi dei batteri con le api e prendono in esame la relazione tra l'alimentazione, il carico patogeno, e la diversità genetica, tutti fattori che sono considerati la chiave per comprendere il declino delle api.

INTRODUZIONE

Le sfide recenti per la salute delle api, tra le quali le drammatiche perdite di colonie attribuibili al Colony Colapse Disorder (CCD) e l'introduzione di parassiti e agenti patogeni nelle colonie, hanno devastato il numero di colonie di api in tutto il mondo. Tuttavia, un  agente unico deve ancora essere identificato e nuove idee sui fattori che potrebbero spiegare il declino della salute delle api stanno ancora emergendo . Allo stato attuale, i ricercatori vedono queste perdite allarmanti come il probabile prodotto di agenti patogeni multipli uniti a fattori di stress cronico, fra cui un' alimentazione povera, l'aumento del carico di agenti patogeni, e la mancanza di diversità genetica tra le operaie nella colonia. Un fattore che viene probabilmente determinato dal genotipo della  colonia ed è fondamentale per alleviare lo stress nutrizionale, ma non è stata ancora pienamente caratterizzato, è la composizione e la funzione dei batteri delle api. La gamma della flora batterica (e altri microbi) che si trova nelle colonie di api può giocare un ruolo chiave nella salute e la vitalità di questi organismi, così come succede nel nostro corpo. I  microrganismi associati all'ape contribuiscono enormemente allo sviluppo del sistema immunitario del loro ospite, alla digestione e al benessere generale.

Molti animali convivono con simbionti batterici che mettono a disposizione dei loro ospiti nutrienti che o sono assenti dalla dieta del loro ospite o comunque non sono disponibili negli alimenti che consumano. Simbiosi di questa natura sono particolarmente critiche per gli animali con diete a base vegetale perché la maggior parte di essi non producono enzimi capaci di  digerire il materiale vegetale (per esempio lignina e polisaccaridi complessi), cosa che molte specie batteriche riescono  invece a fare. Le api da miele (Apis mellifera) hanno una dieta che consiste interamente di alimenti che sono derivati da piante: nettare e polline. Le api processano il nettare trasformandolo in miele, esso costituisce per la colonia la fonte primaria di carboidrati, ma contiene solo tracce di aminoacidi e vitamine. Il polline fornisce alle api praticamente tutte le sostanze nutritive mancanti, tra cui aminoacidi, lipidi, vitamine e minerali.

Tuttavia, i nutrienti citoplasmatici nel polline non sono facilmente disponibili per le api perché ogni grano di polline ha una parete cellulare che è difficile da rompere chimicamente (si tratta uno strato esterno di sporopollenina estremamente resistente oltre al quale si trova uno strato di cellulosa*). Le api sono uno dei pochi insetti in grado di produrre cellulasi [enzima in grado di rompere la cellulosa], ma ciò non elimina del tutto la difficoltà digestione del polline dimostrata dalla notevole proporzione di granelli di polline non del tutto digeriti nell'intestino delle operaie. Inoltre, la maggior parte delle fonti di polline non fornisce il complemento completo delle sostanze nutritive che le api richiedono o possono contenere solo le tracce di alcuni aminoacidi essenziali, e questo significa che le api devono raccogliere un mix di tipi di polline più ampio possibile.

Per risolvere queste difficoltà nella nutrizione, le api di solito non consumano polline grezzo. Le operaie cioè elaborano polline che raccolgono e lo stivano nel favo, aggiungendovi secrezioni ghiandolari,  lo sigillano con una goccia di miele. Il polline così trasformato,  matura in pane d'api dopo diverse settimane, presumibilmente a causa della attività dei microrganismi che vi si trovano, ma che sono assenti all'inizio nel polline grezzo. Il pane d'api è chimicamente diverso dal polline: ha un elevato contenuto di vitamine, minori quantità di polisaccaridi complessi, un diverso profilo degli amminoacidi, e un pH più acido. Viene spesso affermato che questi cambiamenti nella composizione nutrizionale sono il risultato dell'attività metabolica della microflora che è presente nel polline immagazzinato, sebbene gli organismi che partecipano attivamente a questa trasformazione metabolica non sono mai stati  identificati con chiarezza. Studi precedenti hanno caratterizzato alcuni batteri che sono associati con le api utilizzando solo tecniche di coltura o anche approcci non legati alle colture come la clonazione e il sequenziamento 16S rRNA. Gli studi basati sulle colture offrono una prospettiva importante sul mondo dei batteri nelle colonie di api, ma necessariamente escludono la stragrande maggioranza dei batteri, che non sono replicabili in coltura. Studi non legati alle colture batteriche hanno evidenziato qualcosa in più rispetto a ciò, ma sono stati relativamente di piccola portata (sia in termini di prelievo delle api sia di  sequenziamento genetico) e non hanno fatto differenza tra batteri che trasformano  attivamente  il polline in pane d'api rispetto a quelli che sono semplicemente presenti in esso. Anche se gli organismi che sono responsabili di questa trasformazione sono rimasti in gran parte ignoti, è chiaro che il pane d'api è più nutriente per le operaie rispetto al polline non trasformato. Le api alimentate con il primo  vivono più a lungo rispetto a quelle alimentate con il secondo e sono maggiormente in grado di compensare i danni fisiologici da parassiti quando il pane d'api è abbondantemente disponibile. A seguito del modo in cui il pane d'api viene inoculato con i batteri, matura e viene distribuito, la comunità microbica presente in esso agisce come un'estensione dell'intestino della colonia, ed i benefici della sua attività sono condivisi da tutti i membri della colonia.

Un modo in cui la gamma e l'attività microbiotica di una colonia può essere migliorata è attraverso un aumento della diversità genetica della popolazione di operaie. A differenza delle regine della maggior parte delle specie di imenotteri eusociali (api, formiche e vespe), un'ape  regina si accoppia con un gran numero di maschi e introduce quindi nella colonia famiglie di  operaie geneticamente disomogenee provenienti da molti padri. In A. mellifera , ogni regina si  accoppia con una media di 12 maschi, con un record registrato di 44 maschi. La poliandria estrema da parte delle regine è un tratto evolutivo emerso in tempi relativamente recenti, che si trova universalmente nel genere Apis  e, in misura simile in un numero limitato di altri taxa di insetti eusociali, tra cui formiche legionarie e formiche tagliafoglie. L'Ape mellifera beneficia del livello di diversità genetica di una colonia generata dall'estrema poliandria grazie ad una maggiore capacità di mitigare i sintomi di infezione dei parassiti patogeni e a più elevati livelli di stabilità e produttività  della colonia. Questi studi suggeriscono che ci sono svariate ragioni per cui universalmente si seleziona l'ape anche per il carattere di poliandria e disomogeneità genetica all'interno delle colonie che essa genera. Dato il consenso scientifico che il background genetico di un animale impatti in modo significativo sulla composizione del suo microbioma, è possibile che la  genetica in una colonia di api possa anche favorire una più diversificata flora batterica, cosa che a sua volta può conferire o una protezione dalle malattie o un vantaggio nutrizionale a tutti i membri della colonia.

Tenendo a mente il legame tra  salute delle colonie, produttività e nutrizione, abbiamo voluto in questo studio descrivere i batteri attivi associati alle api e i loro prodotti alimentari ponendo  due domande centrali. In primo luogo, abbiamo cercato di caratterizzare la composizione delle comunità batteriche associate alle api per chiarire il ruolo che i microbi attivi svolgono nella maturazione del polline in pane d'api e la rilevanza della loro attività per la nutrizione delle api. In secondo luogo, abbiamo cercato di capire se la maggiore diversità genetica all'interno della popolazione di operaie di una colonia si traduce in cambiamenti  nella composizione dei microrganismi che sono associati alle api e al loro cibo. Per rispondere a queste domande, abbiamo utilizzato il pirosequenziamento, cioè un approccio indipendente dalla tecnica della coltura. Pertanto, i risultati differiscono in modo sostanziale da precedenti relazioni sui batteri che sono associati alle api mellifere perché la gran parte  di microorganismi attivi qui riportati non era mai stato individuato da altri autori.

RISULTATI

I batteri attivi differiscono notevolmente a seconda degli ambienti in cui si trovano nella colonia

Dopo aver elaborato tutti i dati, abbiamo ottenuto un totale di 70.562  sequenze di alta qualità che sono state successivamente classificate per generi batterici. La maggior parte di queste pirosequenze (56.556) provenivano dell'intestino delle api. Il restante delle pirosequenze è suddiviso tra api intere (4471) e  pane d'api (9535) e, sebbene relativamente più piccolo rispetto al numero di sequenze dall'intestino delle api, il set di dati era abbastanza grande tra tutti e tre gli ambienti di prelievo da consentire il confronto della composizione dei loro batteri più attivi. Un totale di 1.019 specie appartenenti a cinque phyla sono stati trovati nei campioni sia dell'intestino delle api, sia delle api intere sia del pan d'api, il phylum dominante secondo I  conteggi in tutti i campioni risulta essere quello dei FirmicutesTabella 1 ). 

Il  polline nelle cellette si presume venga inoculato con i batteri  prima che maturi in pane d'api ed i nostri risultati suggeriscono che il pane d'api e l'intestino delle api contengono 207 specie comuni ad entrambi gli ambienti. Tuttavia, una percentuale considerevole delle specie presenti nell'intestino delle api non è stata ritrovata nel pane d'ape, e viceversa (75% e 46%, rispettivamente). Un nucleo di 103 specie di batteri  è stato identificato in tutti gli ambienti di campionamento (figura 1), il che significa che solo il 10% delle specie batteriche sono completamente condivise da tutti e tre gli ambienti. Quando i campioni sono stati esaminati per determinare i gruppi sulla base delle diversità e abbondanza delle specie, i campioni di batteri intestinali  escludono molte specie provenienti da campioni di api intere e dal pan d'api ( Figura 2 ), e questa cosa suggerisce che, microorganismii attivi interni (cioè, dell'apparato digerente) sono caratterizzati da una flora batterica diversa rispetto agli ambienti esterni delle colonie (pane d'api e api intere, meno facilmente distinguibili l'uno dall'altro). Le specie più attive in tutti e tre gli ambienti della colonia sono state confrontate e sono dominate da quattro phyla ( Tabella 1 , ulteriormente caratterizzata nella prossima sezione) di batteri che si trovano anche nell'intestino di altri animali: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes.

Fig. 1 (A) Rappresentazione a diagramma di Venn della diversità a livello di specie (97% di identità) delle comunità batteriche attive trovati nei tre ambienti di campionamento associati alle api (pane d'api, intestino di api e api intere), aggregati tra tutte le colonie. La quantita' totale di specie è stata 1.019 OTU, e l'ambiente più ricco di specie è risultato essere l'intestino di api (824 specie totali). (B) Il nucleo microbiotico presente  in tutti e tre gli ambienti contai 103 specie appartenenti a  26 generi, con Oenococcus eSuccinivibrionaceae comprendenti le percentuali maggiori.

I batteri associati alla fermentazione di alimenti prodotti dall'uomo  comprendono una parte sostanziale di microorganisimi trovati nelle api, sulle quali non erano mai stati identificati in precedenza. Succinivibrio (associata al rumine della mucca), Oenococcus (importante per la fermentazione del vino), Paralactobacillus ( importante in fermentazione alimentare), e Bifidobacterium (associato allo yogurt) sono stati tra iI sei generi più attivi presenti nei campioni intestinali di api e rappresentato oltre il 67% della comunità batterica attiva in tale ambiente ( Tabella 1 ). Oenococcus e Paralactobacillus sono i microbatteri più attivi nel pane d'api e api intere, e comprende il 52% e il 60% rispettivamente  dei batteri rappresentati in quegli ambienti (Tabella 1 ). Delle 18 specie di campioni di pan d'api, ciascuno dei quali contribuisce per almeno l'1% alla comunità' batterica attiva, 17 sono anaerobi, facoltativi o  obbligati. Queste specie includono molti batteri degli acidi lattici (LAB; Oenoccoccus, ParalactobacillusBifidobacterium), nonché enterici (EnterobacterEscherichia / Shigella, Klebsiella e Serratia). L'attività preponderante degli anaerobi associati al pan d'api e l'intestino delle api suggerisce che la loro presenza è fondamentale nella trasformazione del polline in nutrimento adatto per lo stoccaggio a lungo termine all'interno dell'alveare.

Figura 2.  campioni di colonie di api si raggruppano in base all'ambiente campionato. (A)  raggruppamento (97% di identità) Unifrac ponderati, basati sulle specie, a seconda degli ambienti in ciascuna delle colonie studiate con cladi colorati codificata dal contesto. I rami che rappresentano I batteri  trovati in colonie geneticamente uniformi sono colorati in rosso, I rami neri sono quelli di colonie geneticamente diverse. (B) Ogni colonna sotto un suggerimento albero Unifrac è l'abbondanza classificato delle classi batteriche trovato quel campione, rappresentato come una mappa di calore, le classi più attivi sono stati Bacilli e γ-proteobatteri. Campioni di Bintestino d'ape (in lavanda) cluster per l'esclusione di tutta-bee (in verde) e campioni di api-pane (in rosa), soprattutto a causa della presenza di Succinovibrionaceae . Generi che sono più attivi nel le colonie di api si trovano spesso in ambienti dove avviene la fermentazione anaerobica

I Succinivibrionaceae sono anaerobi obbligati γ-proteobatterici non noti precedentemente in associazione alle api, ma abbiamo riscontrato essere straordinariamente attivi nell'intestino delle api, (sebbene non sono stati trovati né nel pane d'api né sulle api intere). Esemplari del genere Succinivibrio sono noti nel rumine della mucca, dove giocano un ruolo nella digestione degli amidi e nella produzione di acidi organici . La presenza attiva di questo genere nell'intestino dell'ape crea un raggruppamento ad esclusione degli altri ambienti della colonia che sono stati campionati ( Figura 2 ). 

Oenococcus, un altro genere non precedentemente noto in associazione con colonie di api, è stato il secondo genere più comune nei campioni di intestino d'api e il più comune nel pan d'api e in campioni di api intere (Tabella 1). Oenococcus forma anche una grande parte (21%) del nucleo di batteri attivi in tutti i tipi di campioni, il che suggerisce che esso svolga un ruolo significativo nei batteri di colonie di api in generale. Oenococcus oeni , l'unico membro caratterizzato di questo genere, è un batterio lattico anaerobo facoltativo che è ben noto per la sua partecipazione nella fermentazione malolattica del vino. Oenococcus utilizza zuccheri esosi e pentosi come fonti di carboidrati, tra cui cellobiosio, il componente disaccaride della cellulosa.

Bifidobacterium e Paraloctobacillus, due generi potenzialmente probiotici i cui membri sono noti per il loro coinvolgimento nella fermentazione alimentare, sono molto attivi in tutte le  colonie campionate. Paralactobacillus è  parte del nucleo dei batteri della colonia (Figura 1B) e comprende il 10-28% dei batteri totali in ogni tipo di campione. Bifidobacterium rappresenta una frazione più piccola della comunità attiva di tutti gli ambienti della colonia e sono inferiori al 1-4,7% delle sequenze totali. 

È interessante notare che il carico di generi di agenti patogeni vegetali e animali attivi nell'intestine delle api è correlato negativamente con l'attività di Bifidobacterium. Inoltre, il Melissococcus , l'agente eziologico della peste europea, non è mai stato rilevato in colonie con carichi elevati di Bifidobacterium  ed è stato trovato solo in colonie con una presenza ridotta di Bifidobacterium specie cosa che suggerisce che il Bifidobacterium, molte specie del quale sono probiotiche anche in altri sistemi, può fornire una misura di protezione contro le infezioni.

 

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